Влияние иммунных факторов пациентов с сахарным диабетом на жизнеспособность клеток кожи in vitro

На сегодняшний день большой научный интерес представляет изучение роли иммунных факторов в патогенезе язвы стопы при сахарном диабете (СД). Цель исследования – изучить с помощью 3D-клеточной модели in vitro характер взаимодействия между клетками кожи (кератиноциты и фибробласты) и факторами иммунной системы, выделенными из периферической крови пациентов с СД второго типа (СД2) и лиц с СД2 с хронической язвой стопы. Для создания 3D-клеточной модели кожи использовали первичную культуру фибробластов, кератиноциты линии HaCaT (иммортализованные кератиноциты), сыворотку крови и мононуклеары периферической крови пациентов – 9 здоровых доноров без СД, 9 пациентов с СД2 и 9 пациентов с СД2 с синдромом диабетической стопы (СДС) с хронической язвой. При сокультивировании клеток кожи с мононуклеарной суспензией здоровых доноров, пациентов с СД2 и лиц с СДС доля жизнеспособных фибробластов составила 95,40 [91,75; 99,05] % vs 83,78 [79,03; 89,53] % vs 70,18 [66,38; 72,10] % (H = 21,259, p < 0,001), кератиноцитов – 96,40 [92,82; 100,50] % vs 93,61 [86,80; 97,10] % vs 92,87 [85,15; 95,25] % (H = 4,459, p = 0,108) соответственно. При отдельном использовании 20 %-ной сыворотки крови доля жизнеспособных фибробластов в этих группах составила 95,61 [92,39; 100,19] % vs 95,80 [88,99; 102,15] % vs 96,20 [99,69; 88,70] % (H  =  0,353, p  =  0,838), кератиноцитов – 99,40 [95,35; 102,05]  % vs 98,60 [90,55; 100,40]  % vs 94,79 [91,65; 98,16]  % (H = 3,030, p = 0,220) соответственно. Установлено, что мононуклеары, выделенные из периферической крови пациентов с СД2 и СД2 с СДС, значительно снижают выживаемость фибробластов при сокультивировании в 3D-модели кожи in vitro, не оказывая при этом достоверного влияния на жизнеспособность/выживаемость кератиноцитов. В то же время иммунные факторы, содержащиеся в сыворотке крови пациентов указанных выше групп, не оказывали достоверного эффекта на жизнеспособность клеток кожи в 3D-системе in vitro.

1. IDF Diabetes Atlas 9th Edition [Electronic resource] // Int. Diabetes Federation. - Mode of access: https://www.diabetesatlas.org/en/resources. ‒ Date of access: 19.04.2020.

2. Geraghty, T. Current health and economic burden of chronic diabetic osteomyelitis / T. Geraghty, G. LaPorta // Expert Rev. Pharmacoecon. Outcomes Res. - 2019. - Vol. 19, N 3. - P. 279-286. https://doi.org/10.1080/14737167.2019.1567337

3. IDF Clinical Practice Recommendations on the Diabetic Foot - 2017. A guide for healthcare professionals / A. Ibrahim [et al.]. - Brussels : Int. Diabetes Federation, 2017. - 70 р.

4. The 2019 IWGDF Guidance Documents on prevention and management of foot problems in diabetes [Electronic resource] // International Working Group on the Diabetic Foot. - Mode of access: https://iwgdfguidelines.org/guidelines/guidelines. ‒ Date of access: 19.04.2020.

5. Ud-Din, S. Non-animal models of wound healing in cutaneous repair: In silico, in vitro, ex vivo, and in vivo models of wounds and scars in human skin / S. Ud-Din, A. Bayat // Wound Repair Regen. - 2017. - Vol. 25, N 2. - P. 164-176. https://doi.org/10.1111/wrr.12513

6. The development of a 3D immunocompetent model of human skin / D. Y. S. Chau [et al.] // Biofabrication. - 2013. - Vol. 5, N 3. - P. 035011. https://doi.org/10.1088/1758-5082/5/3/035011

7. Ahmed, S. A. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay / S. A. Ahmed, R. M. Gogal, J. E. Walsh // J. Immunol. Meth. - 1994. - Vol. 170, N 2. - P. 211-224. https://doi.org/10.1016/0022-1759(94)90396-4

8. Baltzis, D. Pathogenesis and treatment of impaired wound healing in diabetes mellitus: new insights / D. Baltzis, I. Eleftheriadou, A. Veves // Adv. Ther. - 2014. - Vol. 31, N 8. - P. 817-836. https://doi.org/10.1007/s12325-014-0140-x

9. Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast. impairment in migration, vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia / O. Z. Lerman [et al.] // Am. J. Pathol. - 2003. - Vol. 162, N 1. - P. 303-312. https://doi.org/10.1016/S0002-9440(10)63821-7

10. Three-dimensional human tissue models that incorporate diabetic foot ulcer-derived fibroblasts mimic in vivo features of chronic wounds / A. G. Maione [et al.] // Tissue Eng. Part C Meth. - 2015. - Vol. 21, N 5. - P. 499-508. https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2014.0414

11. Macrophage polarization in obesity and type 2 diabetes: weighing down our understanding of macrophage function? / M. J. Kraakman [et al.]// Front Immunol. - 2014. - Vol. 5. - Art. 470. https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00470

12. Macrophage dysfunction impairs resolution of inflammation in the wounds of diabetic mice / S. Khanna [et al.] // PLoS ONE. - 2010. - Vol. 5, N 3. - P. e9539. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009539

13. Epigenetic changes in bone marrow progenitor cells influence the inflammatory phenotype and alter wound healing in type 2 diabetes / K. A. Gallagher [et al.] // Diabetes. - 2015. - Vol. 64, N 4. - P. 1420-1430. https://doi.org/10.2337/db14-0872

14. Mature B cells accelerate wound healing after acute and chronic diabetic skin lesions / R. F. Sîrbulescu [et al.] // Wound Repair Regen. - 2017. - Vol. 25, N 5. - P. 774-791. https://doi.org/10.1111/wrr.12584

15. Cytokine-defined B cell responses as therapeutic targets in multiple sclerosis / R. Li [et al.] // Front Immunol. - 2016. - Vol. 6. - Art. 626. https://doi.org/10.3389/fimmu.2015.00626

16. Bone marrow-derived B cells preserve ventricular function after acute myocardial infarction / T. T. Goodchild [et al.] // JACC Cardiovasc. Interv. - 2009. - Vol. 2, N 10. - P. 1005‒1016. https://doi.org/10.1016/j.jcin.2009.08.010

17. Antibodies to wounded tissue enhance cutaneous wound healing / N. Nishio [et al.] // Immunology. - 2009. - Vol. 128, N 3. - P. 369‒380. https://doi.org/10.1111/j.1365-2567.2009.03119.x

18. CD19, a response regulator of B lymphocytes, regulates wound healing through hyaluronan-induced TLR4 signaling / Y. Iwata [et al.] // Am. J. Pathol. - 2009. - Vol. 175, N 2. - P. 649‒660. https://doi.org/10.2353/ajpath.2009.080355

19. T and B cells participate in bone repair by infiltrating the fracture callus in a two-wave fashion / I. Könnecke [et al.] // Bone. - 2014. - Vol. 64. - P. 155‒165. https://doi.org/10.1016/j.bone.2014.03.052

20. Absence of CD4 or CD8 lymphocytes changes infiltration of inflammatory cells and profiles of cytokine expression in skin wounds, but does not impair healing / L. Chen [et al.] // Exp. Dermatol. - 2014. - Vol. 23, N 3. - P. 189-194. https://doi.org/10.1111/exd.12346

21. Immune aging in diabetes and its implications in wound healing / J. Moura [et al.] // Clin. Immunol. - 2019. - Vol. 200. - P. 43-54. https://doi.org/10.1016/j.clim.2019.02.002

22. Impaired T-cell differentiation in diabetic foot ulceration / J. Moura [et al.] // Cell. Mol. Immunol. - 2017. - Vol. 14, N 9. - P. 758-769. https://doi.org/10.1038/cmi.2015.116