Использование ПЦР с гидролизными зондами для выявления мутаций устойчивости к фторхинолонам у Mycobacterium tuberculosis

Ранняя диагностика резистентности к фторхинолонам дает возможность своевременно начать адекватную терапию и повышает шансы на благоприятный исход заболевания. Использование молекулярно-генетических методов исследования позволяет получить в течение 1–2 сут результаты определения устойчивости Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным лекарственным средствам, в то время как при использовании классических методов результаты становятся известны почти через 1–2 мес. 

Цель работы – разработка метода детекции M. tuberculosis и точечных мутаций в 90, 91, 94-м кодонах gyrA гена, ассоциированных с устойчивостью к фторхинолонам. 

Исследовано 88 культур микобактерий: M. tuberculosis (n = 81), M. tuberculosis H37Rv, M. chelonae (n = 1), M. gordonae (n = 1), M. fortuitum (n = 1) и 3 изолята других нетуберкулезных микобактерий. Типы мутаций в гене gyrA изучены с помощью разработанного метода ПЦР в реальном времени, стандартного метода GenoType MTBDRsl (HAIN, Германия) и секвенирования по Сэнгеру. Анализ мутаций в gyrA гене 78 изолятов M. tuberculosis показал, что доминирующими были мутации p.Asp94Gly и p.Ala90Val, которые идентифицированы у 21 и 27 изолятов соответственно: в структуре мутаций на их долю приходится 64 %. У M. tuberculosis встречались также мутации p.ASP94ALA и p.ASP94TYR/HIS – у 6 (8,0 %) и 9 (12,0 %) изолятов соответственно. У одного штамма присутствовала мутация в 88-м кодоне и у одного штамма найдена двойная мутация (ALA90VAL и ASP94GLY). Результаты по выявлению мутаций разработанным методом ПЦР в реальном времени совпадают с результатами GenoType MTBDRsl и секвенирования. Разработанный метод ПЦР в реальном времени демонстрирует высокую частоту совпадений с данными фенотипического определения устойчивости к офлоксацину и результатами тестирования с помощью стандартного метода GenoType MTBDRsl и секвенирования. С помощью данного метода можно выявлять возбудителей туберкулеза, дискриминировать мутации p.ALA90VAL, p.SER91PRO, p.ASP94ALA, p.ASP94TYR/HIS, p.ASP94GLY, p.ASP94ASN, что позволяет диагностировать устойчивость к фторхинолонам. 

1. Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis and mutations in gyrA and gyrB / A. Von Groll [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2009. – Vol. 53, N 10. – P. 4498–4500. https://doi.org/10.1128/AAC.00287-09

2. Population-based resistance of Mycobacterium tuberculosis isolates to pyrazinamide and fluoroquinolones: results from a multicountry surveillance project / M. Zignol [et al.] // Lancet Infect. Dis. – 2016. – Vol. 16, N 10. – P. 1185–1192. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(16)30190-6

3. Zhang, Y. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: update 2015 / Y. Zhang, W.-W. Yew // Int. J. Tuberc. Lung Dis. – 2015. – Vol. 19, N 11. – P. 1276–1289. https://doi.org/10.5588/ijtld.15.0389

4. Extensively drug-resistant tuberculosis: epidemiology and management challenges / K. Dheda [et al.] // Infect. Dis. Clin. – 2010. – Vol. 24, N 3. – P. 705–725. https://doi.org/10.1016/j.idc.2010.05.001

5. Extensively drug-resistant tuberculosis, Italy and Germany / G. B. Migliori [et al.] // Emerg. Infect. Dis. – 2007. – Vol. 13, N 5. – P. 780–782. https://doi.org/10.3201/eid1305.060200

6. Extensively drug–resistant, tuberculosis in South Korea: risk factors and treatment outcomes among patients at a tertiary referral hospital / C. Y. Jeon [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 2008. – Vol. 46, N 1. – P. 42–49. https://doi.org/10.1086/524017

7. Collins, C. H. In–vitro susceptibility of mycobacteria to ciprofloxacin / C. H. Collins, A. H. Uttley // J. Antimicrob. Chemother. – 1985. – Vol. 16, N 5. – P. 575–580. https://doi.org/10.1093/jac/16.5.575

8. Drlica, K. Fluoroquinolones: action and resistance / K. Drlica, M. Malik // Curr. Top Med. Chem. – 2003. – Vol. 3, N 3. – P. 249–282. https://doi.org/10.2174/1568026033452537

9. Epidemiology and clinical management of XDR–TB: a systematic review by TBNET / G. Sotgiu [et al.] // Eur. Resp. J. – 2009. – Vol. 33, N 4. – P. 871–881. https://doi.org/10.1183/09031936.00168008

10. Fluoroquinolone resistance: mechanisms, impact on bacteria, and role in evolutionary success / L. S. Redgrave [et al.] Trends Microbiol. – 2014. – Vol. 22, N 8. – P. 438–445. https://doi.org/10.1016/j.tim.2014.04.007

11. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis: epidemiology and control / A. Matteelli [et al.] // Expert Rev. Anti-infect. Ther. – 2007. – Vol. 5, N 5. – P. 857–871. https://doi.org/10.1586/14787210.5.5.857

12. Alangaden, G. J. The clinical use of fluoroquinolones for the treatment of mycobacterial diseases / G. J. Alangaden, S. A. Lerner // Clin. Infect. Dis. – 1997. – Vol. 25, N 5. – P. 1213–1221. https://doi.org/10.1086/516116

13. Cambau, E. Amplification and nucleotide sequence of the quinolone resistance-determining region in the gyrA gene of mycobacteria / E. Cambau, W. Sougakoff, V. Jarlier // FEMS Microbiol. Lett. – 1994. – Vol. 116, N 1. – P. 49–54. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1994.tb06674.x

14. Cloning and nucleotide sequence of Mycobacterium tuberculosis gyrA and gyrB genes and detection of quinolone resistance mutations / H. E. Takiff [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 1994. – Vol. 38, N 4. – P. 773–780. https://doi.org/10.1128/AAC.38.4.773

15. Comprehensive treatment of extensively drug-resistant tuberculosis / C. D. Mitnick [et al.] // New Engl. J. Med. – 2008. – Vol. 359, N 6. – P. 563–574. https://doi.org/10.1056/NEJMoa0800106

16. Piddock, L. J. V. Mechanisms of resistance to fluoroquinolones: state-of-the-art 1992–1994 / L. J. V. Piddock // Drugs. – 1995. – Vol. 49, suppl. 2. – P. 29–35. https://doi.org/10.2165/00003495-199500492-00006

17. Whole-genome sequencing has the potential to improve treatment for rifampicin-resistant tuberculosis in high-burden settings: a retrospective cohort study / H. Cox [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2022. – Vol. 60, N 3. – P. e02362–21. https://doi.org/10.1128/jcm.02362-21

18. Multidrug-resistant tuberculosis in Europe, 2010–2011 / G. Günther [et al.] // Emerg. Infect. Dis. – 2015. – Vol. 21, N 3. – P. 409. https://doi.org/10.3201/eid2103.141343

19. Yin, X. Mutation characterization of gyrA and gyrB genes in levofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Guangdong Province in China / X. Yin, Z. Yu // J. Infect. – 2010. – Vol. 61, N 2. – P. 150–154. https://doi.org/10.1016/j.jinf.2010.05.001

20. Molecular characterization of ofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Russia / I. Mokrousov [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2008. – Vol. 52, N 8. – P. 2937–2939. https://doi.org/10.1128/AAC.00036-08

21. Fluoroquinolone susceptibility among Mycobacterium tuberculosis isolates from the United States and Canada / L. Bozeman [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 2005. – Vol. 40, N 3. – P. 386–391. https://doi.org/10.1086/427292